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高速離心技術在生物學上應用

 二維碼 291
作者:Crystalgen

高速離心技術在生物學上應用

前言:離心技術在生物科學,特別是在生物化學和分子生物學研究領域,已得到十分廣泛的應用,每個生物化學和分子生物學實驗室都要裝備多種型式的離心機。離心技術主要用于各種生物樣品的分離和制備,生物樣品懸浮液在高速旋轉下,由于巨大的離心力作用,使懸浮的微小顆粒(細胞器、生物大分子的沉淀等)以一定的速度沉降,從而與溶液得以分離,而沉降速度取決于顆粒的質量、大小和密度。  


制備性超速離心的分離方法:  


1. 差速沉降離心法:  

這是最普通的離心法。即采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進行離心,使沉降速度不同的顆粒,在不同的離心速度及不同離心時間下分批分離的方法。此法一般用于分離沉降系數相差較大的顆粒。  

差速離心首先要選擇好顆粒沉降所需的離心力和離心時間。當以一定的離心力在一定的離心時間內進行離心時,在離心管底部就會得到最大和最重顆粒的沉淀,分出的上清液在加大轉速下再進行離心,又得到第二部分較大較重顆粒的沉淀及含較小和較輕顆粒的上清液,如此多次離心處理,即能把液體中的不同顆粒較好地分離開。此法所得的沉淀是不均一的,仍雜有其它成分,需經過2~3次的再懸浮和再離心,才能得到較純的顆粒。  

此法主要由于組織勻漿液中分離細胞器和病毒,其優點是:操作簡易,離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開,并可使用容量較大的角式轉子。缺點是:須多次離心,沉淀中有夾帶,分離效果差,不能一次得到純顆粒,沉淀于管底的顆粒受擠壓,容易變性失活。

2. 密度梯度區帶離心法(簡稱區帶離心法):  

區帶離心法是將樣品加在惰性梯度介質中進行離心沉降或沉降平衡,在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上,形成不同區帶的分離方法。

此法的優點是:①分離效果好,可一次獲得較純顆粒;②適應范圍廣,能象差速離心法一樣分離具有沉降系數差的顆粒,又能分離有一定浮力密度差的顆粒;③顆粒不會擠壓變形,能保持顆?;钚?,并防止已形成的區帶由于對流而引起混合。  

此法的缺點是:①離心時間較長;②需要制備惰性梯度介質溶液;③操作嚴格,不易掌握。

密度梯度區帶離心法又可分為兩種:  

(1)差速區帶離心法:當不同的顆粒間存在沉降速度差時(不需要像差速沉降離心法所要求的那樣大的沉降系數差)。在一定的離心力作用下,顆粒各自以一定的速度沉降,在密度梯度介質的不同區域上形成區帶的方法稱為差速區帶離心法。此法僅用于分離有一定沉降系數差的顆粒(20% 的沉降系數差或更少)或分子量相差3倍的蛋白質,與顆粒的密度無關,大小相同,密度不同的顆粒(如線粒體,溶酶體等)不能用此法分離。  離心管先裝好密度梯度介質溶液,樣品液加在梯度介質的液面上,離心時,由于離心力的作用,顆粒離開原樣品層,按不同沉降速度向管底沉降,離心一定時間后,沉降的顆粒逐漸分開,最后形成一系列界面清楚的不連續區帶,沉降系數越大,往下沉降越快,所呈現的區帶也越低,離心必須在沉降最快的大顆粒到達管底前結束,樣品顆粒的密度要大于梯度介質的密度。梯度介質通常用蔗糖溶液,其最大密度和濃度可達1.28 kg/cm3和60%。

此離心法的關鍵是選擇合適的離心轉速和時間  

(2)等密度區帶離心法:離心管中預先放置好梯度介質,樣品加在梯度液面上,或樣品預先與梯度介質溶液混合后裝入離心管,通過離心形成梯度,這就是預形成梯度和離心形成梯度的等密度區帶離心產生梯度的二種方式。

離心時,樣品的不同顆粒向上浮起,一直移動到與它們的密度相等的等密度點的特定梯度位置上,形成幾條不同的區帶,這就是等密度離心法。體系到達平衡狀態后,再延長離心時間和提高轉速已無意義,處于等密度點上的樣品顆粒的區帶形狀和位置均不再受離心時間所影響,提高轉速可以縮短達到平衡的時間,離心所需時間以最小顆粒到達等密度點(即平衡點)的時間為基準,有時長達數日。  

等密度離心法的分離效率取決于樣品顆粒的浮力密度差,密度差越大,分離效果越好,與顆粒大小和形狀無關,但大小和形狀決定著達到平衡的速度、時間和區帶寬度。等密度區帶離心法所用的梯度介質通常為氯化絕CSCl,其密度可達1.7 g/cm3。此法可分離核酸、亞細胞器等,也可以分離復合蛋白質,但簡單蛋白質不適用。

收集區帶的方法有許多種,例如:  

(1) 用注射器和滴管由離心管上部吸出。

(2) 有針刺穿離心管底部滴出。  

(3) 用針刺穿離心管區帶部份的管壁,把樣品區帶抽出。  

(4)  用一根細管插入離心管底,泵入超過梯度介質最大密度的取代液,將樣品和梯度介質壓出,用自動部分收集器收集。    


離心操作的注意事項  


高速與超速離心機是生化實驗教學和生化科研的重要精密設備,因其轉速高,產生的離心力大,使用不當或缺乏定期的檢修和保養,都可能發生嚴重事故,因此使用離心機時都必須嚴格遵守操作規程。  

1. 使用各種離心機時,必須事先在天平上精密地平衡離心管和其內容物,平衡時重量之差不得超過各個離心機說明書上所規定的范圍,每個離心機不同的轉頭有各自的允許差值,轉頭中絕對不能裝載單數的管子,當轉頭只是部分裝載時,管子必須互相對稱地放在轉頭中,以便使負載均勻地分布在轉頭的周圍。  

2. 裝載溶液時,要根據各種離心機的具體操作說明進行,根據待離心液體的性質及體積選用適合的離心管,有的離心管無蓋,液體不得裝得過多,以防離心時甩出,造成轉頭不平衡、生銹或被腐蝕,而制備性超速離心機的離心管,則常常要求必須將液體裝滿,以免離心時塑料離心管的上部凹陷變形。每次使用后,必須仔細檢查轉頭,及時清洗、擦干,轉頭是離心機中須重點保護的部件,搬動時要小心,不能碰撞,避免造成傷痕,轉頭長時間不用時,要涂上一層上光臘保護,嚴禁使用顯著變形、損傷或老化的離心管。  

3. 若要在低于室溫的溫度下離心時。轉頭在使用前應放置在冰箱或置于離心機的轉頭室內預冷。

4. 離心過程中不得隨意離開,應隨時觀察離心機上的儀表是否正常工作,如有異常的聲音應立即停機檢查,及時排除故障。  

5. 每個轉頭各有其最高允許轉速和使用累積限時,使用轉頭時要查閱說明書,不得過速使用。每一轉頭都要有一份使用檔案,記錄累積的使用時間,若超過了該轉頭的最高使用限時,則須按規定降速使用


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文章分類: 行業新聞
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